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利用CRISPR/Cas9技术敲除拟南芥某一功能未知的基因，流程是怎样的？急求！！！！
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就是这个问题，
还有一个可以将目的基因整合进去？基本过程又是什么？
希望大神帮忙啊，
不要给推荐文献了，直接说一下过程吧，谢啦，明天下午就考试了呢。。
用CRISPR-P设计sgRNA
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淘豆网网友近日为您收集整理了关于基因编辑方法CRISPR-Cas9解析的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：CRISPR-Cas9一种新型基因编辑方法又称基因组定点修饰技术,通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变,从而解答并提出更多精确的生物学问题。方法包括:?锌指核酸酶(Zinc-fingernuclease,ZFN)技术?转录激活因子样效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)技术?Cas9/gRNA系统(CRISPR-cas9技术)基因组编辑技术3Cell2-1278Figure2B不论是TALEN技术还是ZFN技术,其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由蛋白特异结合域定位,DNA切割域剪切。锌指核酸酶(ZFN)&转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术Cell2-1278Figure2ACRISPR-Cas9技术?原理:规律性重复短回文序列簇(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPRs)?CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免疫防御机制,研究者根据CRISPR-Cas系统的特性对此系统进行改造产生了第3代人工核酸内切酶技术——CRISPR-Cas9技术。该技术通过小片段的RNA介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、降解。?CRISPR-Cas9技术是一种多物种适应性的,位点特异性的有效基因组编码工具。Cell2-1278Figure4CRISPR-Cas9技术从已知的序列中通过PAM进行定位寻找合适的靶位点并合成gRNA构建gRNA与/Cas9重组质粒。对重组质粒进行活性检测,敲除活性的计算挑选活性较高的敲除质粒导入培养的细胞或者生物体内进行基因组定点编辑操作利用测序、RFLP等方法检测基因组定点修饰结果6sgRNA的设计?选择PAM(NGG)5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列,即敲除的靶位点。(PAM,Protospaceradjacentmotifs原间隔序列临近基序。一般形式为NGG,其作用是将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的DNA序列中)原则:?选择的序列必须在全基因组中进行比对,原间隔序列必须唯一,否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。?优先选择DSB位点的侧翼存在重复序列(如果DSB的侧翼存在重复序列,在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基的缺失)。?PAM的5‘端尽量存在酶切位点。(有利于后期的活性检测)7构建重组质粒构建方案:1.一是将gRNA与Cas9连入同一个质粒载体中并以双启动子启动,载体中携带荧光报告基因(用于流式细胞仪筛选)或抗性基因(用于药物筛选)。2.二是将gRNA与Cas9分别连载不同的载体上,两个载体携带有不同的荧光报告基因或抗性基因载体选择:慢病毒载体以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基因治疗载体。区别于腺病毒载体,可实现外源基因在目标细胞内稳定的传代表达。gRNA的活性检测?限制性内切酶法当Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在限制性内切酶切位点时,如果通过Cas9/sgRNA发生突变,这个位点将可能被破坏,而不能被内切酶酶切。可采用电泳的方法估计突变效率,以突变效率的高低来衡量sgRNA的活性。?非配对内切酶法T7核酸内切酶I(T7endonucleaseI,T7E1)能够识别不完全配对DNA并对其进行切割,如果通过Cas9/sgRNA发生突变,将基因组DNA做PCR,将相对应的PCR产物与野生型DNA的PCR产物等量混合,并退火杂交,将产生非配对DNA片段,将能被非配对内切酶T7E1剪切。用电泳的方法估计突变效率,以突变效率的高低来衡量sgRNA的活性。?SSA活性检测一个终止子插入luciferase(GFP)的编码区中央,luciferase(GFP)就会失去活性。为检测Cas9/sgRNA剪切活性,将一个Cas9/sgRNA的靶点位置序列插在终止子后。在Cas9/sgRNA的作用下,靶点位置产生DSB,细胞通过同源重组方式修复DNA,形成一个有活性的luciferase。通过与对照组的比值变化就可反应Cas9/sgRNA剪切的活性水平。9降低sgRNA/Cas9脱靶率的方法Cas9的两个内切酶活性域为RuvC和HNH,两个亚基分别负责对一条DNA单链的切割。任一亚基的失活都将形成DNA单链断裂(nickedDNA)。当结合于两条互补的DNA链上相邻位置的一对sgRNA同时引导Cas9D10A识别并切割靶位点时才能造成DSB,从而加大了识别的长度,有效的提高了Cas9-sgRNA技术的特异性。Cell2-1278Figure6A,B10重组质粒导入细胞/生物体C、将编码Cas9和sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。D、将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵,快速得到转基因动物模型。E、将编码CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组织或细胞,完成特定时间,组织的基因编辑。Cell2-1278Figure6C,D,E1播放器加载中，请稍候...
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CRISPR-Cas9一种新型基因编辑方法又称基因组定点修饰技术,通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变,从而解答并提出更多精确的生物学问题。方法包括:?锌指核酸酶(Zinc-fingernuclease,ZFN)技术?转录激活因子样效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)技术?Cas9/gRNA系统(CRISPR-cas9技术)基因组编辑技术3Cell2-1278Figure2B不论是TALEN技术还是ZFN技术,其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由蛋白特异结合域定位,DNA切割域剪切。锌指核酸酶(ZFN)&转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术Cell2-1278Figure2ACRISPR-Cas9技术?原理:规律性重复短回文序列簇(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPRs)?CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免疫防御机制,研究者根据CRISPR-Cas系统的特性对此系统进行改造产生了第3代人工核酸内切酶技术——CRISPR-Cas9技术。该技术通过小片段的RNA介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、降解。?CRISPR-Cas9技术是一种多物种适应性的,位点特异性的有效基...
内容来自淘豆网转载请标明出处.CRISPR/Cas9载体构建 - 技术服务 - 赢润生物CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用--《科学技术与工程》2016年20期
CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用
【摘要】：建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。
【作者单位】：
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【分类号】：Q78【正文快照】：
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>> CRISPR/Cas9基因编辑最新亮点论文一览
CRISPR/Cas9基因编辑最新亮点论文一览
来源：生物谷
日讯 /生物谷BIOON/ --CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，其以消灭外来的质体或者噬菌体并在自身基因组中留下外来基因片段作为&记忆&。CRISPR/Cas系统全名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。目前已发现三种不同类型的 CRISPR/Cas系统，存在于大约40%和90%已测序的细菌和古菌中。其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白&以及向导RNA(gRNA)为核心的组成。由于其对DNA干扰(DNAi)的特性，目前被积极地应用于遗传工程中，作为基因体剪辑工具，与锌指核酸酶(ZFN)及类转录活化因子核酸酶(TALEN)同样利用非同源性末端接合(NHEJ)的机制，于基因体中产生去氧核糖核酸的双股断裂以利剪辑。二型CRISPR/Cas并经由遗传工程的改造应用于哺乳类细胞及斑马鱼的基因体剪辑。其设计简单以及操作容易的特性为最大的优点，未来将可应用在各种不同的模式生物当中。
由于CRISPR/Cas技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台，受到众多科学家的追捧。CRISPR-Cas技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。
下面小编为大家盘点一下近期跟CRISPR/Cas9相关的最新研究论文。
在microRNA的5'端区域通过CRISPR/Cas9诱导的小片段插入缺失引起microRNA的消耗及酶类 RNase III（Drosha）加工的迟缓
RNA Biol. 2015 Jan 15
在猴子胚胎干细胞中利用CRISPR/Cas9系统通过同源重组实现对基因的打靶
Stem Cells Dev. 2015 Jan 12
在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9来进行一代基因突变
J Vis Exp. 2014 Jan 3;(83). doi: 10..
利用CRISPR/Cas9系统实现对范可尼贫血疾病患者机体的基因编辑
Hum Gene Ther. 2014 Dec 29
利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对秀丽隐杆线虫进行双重sgRNA定向基因的敲除
Sci Rep. 2014 Dec 22;4:7581. doi: 10.1038/srep07581.
利用CRISPR/Cas9在人类的造血干细胞和效应细胞中实现有效的基因剔除
Cell Stem Cell. 2014 Nov 6;15(5):643-52. doi: 10.1016/j.stem.
利用CRISPR/Cas9对乙肝病毒靶向作用
Mol Ther Nucleic Acids. 2014 Dec 16;3:e216. doi: 10.1038/mtna.2014.68
在人类细胞中实现CRISPR/Cas9介导的EB病毒的基因组编辑
J Gen Virol. 2014 Dec 12. pii: jgv.0.000012. doi: 10.1099/jgv.0.000012
在基因组尺度上利用CRISPR/Cas9 技术进行敲除筛选使得MAGeCK可以增强必要基因的鉴别
Genome Biol. 2014 Dec 5;15(12):554.
利用CRISPR/Cas9技术可以快速简单实现体内染色体的重排
Cell Rep. 2014 Nov 20;9(4):1219-27. doi: 10.1016/j.celrep.
基于CRISPR/Cas9来对细胞谱系进行重编程
Stem Cell Reports. 2014 Dec 9;3(6):940-7. doi: 10.1016/j.stemcr.
利用CRISPR/Cas9技术对植物基因组进行编辑
Curr Opin Biotechnol 2014 Nov 29;32C:76-84. doi: 10.1016/j.copbio.
在果蝇中利用优化的sgRNA参数来增强CRISPR/Cas9 系统的特异性和有效性
Cell Rep. 2014 Nov 6;9(3):1151-62. doi: 10.1016/j.celrep.
在后生动物Nematostella vectensis的早期分支中利用TALEN和CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑
Nat Commun. 2014 Nov 24;5:5486. doi: 10.1038/ncomms6486.
在人类细胞系中利用CRISPR/Cas9 系统靶向作用非编码的RNAs
Nucleic Acids Res. 2014 Nov 20
在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9介导eGFP向Gal4转基因株系进行转化
Nat Protoc. ):2823-40. doi: 10.1038/nprot.
利用CRISPR/Cas9 实现兆碱基级别的剔除来产生完整单倍体的人类细胞系
Genome Res. ):2059-65. doi: 10.1101/gr.
利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统在体内实现工程化的致瘤染色体的重组
Nature. 2014 Dec 18;516(. doi: 10.1038/nature13902.
利用CRISPR/Cas9系统实现基因组的修饰
FEBS J. ):5186-93. doi: 10.1111/febs.13110
利用 CRISPR/Cas9 系统在金黄地鼠机体中实现有效的基因靶向作用
PLoS One. 2014 Oct 9;9(10):e109755. doi: 10.1371/journal.pone.0109755
利用CRISPR/Cas9进行可编程的RNA的识别及分裂
Nature. 2014 Dec 11;516(. doi: 10.1038/nature13769
利用CRISPR/Cas9介导的基因工程化技术在携带报道/驱动基因的转基因斑马鱼机体中实现基因的有效敲除
Sci Rep. 2014 Oct 8;4:6545. doi: 10.1038/srep06545
利用CRISPR/Cas9 系统开发出了一种新型的用于进行动物和人类细胞基因组修饰的有效分型方法
Sci Rep. 2014 Sep 19;4:6420. doi: 10.1038/srep06420
通过CRISPR/Cas9介导的种系DNA编辑可有效抑制小鼠肌肉萎缩症的发生
Science. 2014 Sep 5;345(-8. doi: 10.1126/science.1254445.
全基因组测序技术揭示了CRISPR/Cas9 和TALEN可以在人类iPSCs中实现高效的基因编辑
Cell Stem Cell. 2014 Jul 3;15(1):12-3. doi: 10.1016/j.stem..
利用CRISPR/Cas9 对人类基因组中的脱靶点进行全基因组鉴别
Cell Res. ):1009-12. doi: 10.1038/cr.2014.87.
利用CRISPR/CAS9技术对多种弓形虫进行有效的基因破坏
MBio. 2014 May 13;5(3):e01114-14. doi: 10.1128/mBio.01114-14.
在人类细胞的功能性基因组中对CRISPR/Cas9 文库进行高通量筛选
Nature. 2014 May 22;509(. doi: 10.1038/nature13166
CRISPR/Cas9 技术进行基因组编辑的进展、应用及未来面对的挑战
Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6. doi: 10.1093/hmg/ddu125
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