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PCR引物设计概述
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荧光定量PCR引物设计原则
导读：1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性，11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，13.引物设计避免DNA污染，17.引物设计的软件Primer5.0有专门针对荧光的，设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率，引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡，设计引用有一些需要注意的基本原理：，标记生
1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域
内，可以用DNAman,Alignment 软件 看看结果。
2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
5.碱基要随机分布，尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
16.TM值在58-62度之间。
17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理：
① 引物长度
一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
③ 退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。
④ 避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
⑤ 与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。选择Align two sequences (bl2seq)，如下图。
BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。
将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的GI
号也可以直接
输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。
可是使用BLAST还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。
⑥ 引物末端
引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
⑦ 引物的二级结构
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
⑧ 为了下一步操作而产生的不完全匹配
5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。
很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。
a 添加限制性内切酶酶切位点
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PCR产物的克隆
来源：青年人()&更新时间： 20:35:33 &【字体： 】
PCR［1］的问世，引发了分子生物学技术的一场革命。其意义足以与限制性内切酶技术及Southern印迹技术相媲美，PCR现已成为许多分子生物实验室的常规技术，克隆PCR产物，以进行下一步工作，也随之成为实验室经常要遇到的问题。同时，一些近年发展起来的新技术，如cDNA Selection,inter-ALU PCR，要求克隆大小在一定范围内连续分布的PCR产物，相当于建立一个小规模的文库，高效的克隆PCR产物显得尤为重要。然而，PCR产物克隆较一般的DNA片段克隆更为困难，这可能是因为PCR产物的末端并不是单一的平头［2］，而是由3′端凸出一个碱基的片段(由于Taq聚合酶的末端转移酶活性所致)和5′端凸出一个至数个碱基的片段(由Taq聚合酶的不完全加工所致)组成。我们就近年来发展起来的各种PCR产物克隆技术做一探讨。　　PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可以用EcoRⅤ或SmaⅠ切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶Ⅰ作用30分钟(利用该酶的3′→5′外切酶活性和5′→3′的聚合酶活性)。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5′→3′校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端化处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。然而，Liu等和宋莉等［3］发现，如果使用SmaⅠ平头化载体，甚至不用SmaⅠ预先处理载体，而直接在连接反应体系中加入一定量的SmaⅠ，即可大大提高连接效率。可能的解释是SmaⅠ不断切开因自连而恢复了它的识别序列的载体，大大地降低了自连所产生的背景；而载体与PCR产物连接形成的重组子则不能被切开，使得连接系统的酶反应动力学向着有利于形成重组子的方向进行。选择SamⅠ是这个系统的关键，SmaⅠ在各种连接酶的反应缓冲体系中都能保持一定活力；它的最适温度也较大多数内切酶低，为25℃，可以和连接酶较好地匹配；另外，SmaⅠ的识别序列为5′-CCCGGG-3′，在基因组中存在的机率较少，一般的PCR产物中也很少这种序列。如果PCR产物中有SmaⅠ切点，可以考虑用SrfⅠ。SrfⅠ的识别序列有8个碱基，可大大减少PCR产物中出现的机率。这个系统已由Stratagene公司开发出商品化的试剂盒。　　Jean-Luc等［4］提出了另外一种方案，即先对载体和PCR产物作普通的平头连接，然后用载体上克隆位点两侧的引物对连接产物进行PCR扩增，将很少的重组子大量扩增；回收PCR产物，引物的5′端引入了限制性内切酶位点，用此限制性内切酶消化PCR产物，回收后的PCR产物再与用同样的限制性内切酶处理过的载体连接。对引物的5′端加入不同的限制性内切酶识别序列，可以做到定向连接。由于应用了PCR，可以将很少的平头连接产物扩增出来，因而可以保证100%地克隆到目的片段，但操作过余繁杂，如果PCR产物不是分子量很大或产量不是很少，一般不为采用。　　粘头连接也可以大致分为两类，一类利用一部分PCR产物3′端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3′端带有凸出的dTMP的载体［5］。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时(也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底)。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。如果使用ddTTP［6］，效果会更好。这种方法一般称为加T／A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。从另外一个角度出发，能产生3′端突出dTMP的限制性内切酶也可以完成这一任务。这类酶有SacⅠ，PvuⅠ，Aat Ⅰ，PacⅠ［7］及HphⅠ，MboⅡ，XcmⅠ［8］等。前4类酶产生有2个或4个碱基突出的粘性末端，最后一个碱基是T。尽管如此，连接产物还是可以正常转化，其缺口在导入宿主细胞后可被修复。由于载体要去磷酸化，引物的5′端需要用T4多核苷酸激酶磷酸化。如果PCR产物中没有酶切位点，酶切反应和连接反应可以在同一离心管中进行。后3种中内切酶产生只有1个突出碱基的粘性末端，其中1/4的概率是T，可以与PCR产物末端匹配。然而，由和MboⅡ消化所产生的粘性末端很难重新连接，原因还不清楚。HphⅠ虽没有上述问题，但在一般克隆载体，如pBR322,pUC18/19，pBLUESCR-IPTR等中，有很多酶切位点。因此需要构建特殊载体，如David［8］等人的pCR2001。这种方法的效率较平头连接也要高50倍。　　另一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。最普通的方法是在引物的5′端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。不言而喻，PCR产物中不能有所选用的限制性内切酶的识别序列，这是该方法的最大限制。另外，一般的限制性内切酶要求其识别序列至少离DNA末端要有两个碱基，某些限制性内切酶甚至要求更多，才能保证反应效率，因此需要合成较长的引物，这也是令人讨厌的。近年来发展起来几种不依赖连接的方法，分述如下。　　第1种方法利用T4 DNA聚合酶具有3′→5′外切酶活性和5′→3′聚合酶活性的特性。T4 DNA聚合酶在一定浓度dNTP存在下，如果模板为带有3′突出末端的双链，且反应体系中只有一种dNTP，那么它将沿双链DNA底物3′→5′方向外切，直到它遇到模板上与反应体系中存在那种dNTP相同的那个核苷酸。此时聚合酶活性与外切酶活性保持平衡，产生5′端突出的粘性末端。因此，如果在引物末端引入一段序列［9，10］，它的互补链在某一位置缺少某个碱基，同时，在载体的多克隆位点上也设计相应引物，它包含两个区域，3′侧区域能扩增出整个载体，5′侧区域与插入片段引物5′端互补，它们互补链缺少的碱基也互补。这样，两对引物的扩增产物用T4 DNA聚合酶和相应的dNTP处理后，混合，退火，就可以转化了。为保证退火的粘性末端足够稳定，载体和插入片段引物的5′端至少要有12个碱基互补。详见图1。这种方法效率很高，每微克载体可以产生2～5×105个重组子。　　第2种方法［11，12］利用外切酶Ⅲ来产生粘性末端。外切酶Ⅲ的3′→5′外切酶活性没有序列特异性，它以稳定的，依赖于温度的速率降解线性双链DNA，在4℃时，降解的0速率约为每分钟25个碱基。据此，在两个引物的5′端加入不同的限制性内切酶识别序列，并由激酶在5′端加上磷酸基团。完成正常的PCR反应后，PCR产物在4℃用外切酶Ⅲ消化30秒钟，立即酚抽提终止反应，就可以与经相应的双酶消化好的载体连接了。载体与插入片段上的单链区域可以转化后在细胞内修复。如果引物与载体的配对区域足够长(如10nt)，退火可以在较高的温度(37℃～42℃)和较短的时间(5～10分钟)内完成，并且能大大降低载体的自连背景。这种方法效率也很高，但实际操作中外切酶消化时间很不容易掌握。　　第3种方法［13］采用一种特殊的酶：Enase:Eam11041。这种酶在它的识别序列(5′CTCTTC)的外侧切割双链DNA，并对甲基化敏感。设计5′带有Eam11041识别序列的引物分别扩增目的片段和载体，产物用Eam11041消化后就可以连接了。如果担心目的片段和载体内有Eam11041的识别序列，用m5dCTP代替dCTP作PCR反应，目的片段和载体内部的识别序列受甲基化保护，但引物上的识别序列由于互补链中没有C而不受影响。适当设计目的片段和载体引物的5′端引入序列，便可以做到定向连接(图2)。
图1　利用T4 DNA聚合酶产生粘性末端
　　　　　图2　利用Eam1041产生粘性末端
　　第4种办法［14］使用的酶是噬菌体T7 Gene 6外切酶。这种酶对双链线状DNA有5′→3′外切酶活性，而不论5′端是羟基还是磷酸基，对磷酸二酯键的活性大大高于磷硫键。由此，设计含两个结构域的引物，5′端的结构域与载体多克隆位点上所选用内切酶的切点一侧的序列互补；3′端的结构域是目的片段特异的引物。两个结构域之间由磷硫键连接。这样，PCR产物与处理好的载体用此酶消化后就可以退火、转化了。这种方法同样要求配对区域有10多个碱基，也可以做到定向连接，效率也很高。对几个kb长的PCR产物，转化效率也可高达103～104重组子每微克DNA(图3)。　　第5种方法［15］利用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)能选择性降解DNA中dUMP的性质，在引物的5′端加入一端长为12个碱基的序列，其中T被U代替。由它扩增出的PCR产物，经UDG消化，能产生12个碱基长的粘性末端。载体线性化，加上与上面序列相互补的接头后，PCR产物和载体就可以退火、转化了。UDG在Taq DNA聚合酶的反应缓冲体系中仍有相当活力，因此不用更换离心管，UDG消化、PCR产物与载体退火可同时在PCR反应管中完成，并能直接转化感受态细胞。这种方法的效率较T／A策略高50～100倍，几乎所有转化子都有插入片段。Life Technologies公司已出试剂盒(图4)。　　第6种［16］方法不依靠任何限制性内切酶来产生粘性末端，也不需要连接酶，但要设计很长的目的片段上的引物，同时需要有能扩增出整个载体的内外侧两对引物。目的片段引物的5′端引入载体的外侧引物，扩增目的片段，同时用外侧引物扩增出载体，由于目的片段和载体都有外侧引物，PCR产物可以与线性化的载体退火，经Taq DNA聚合酶补平后，用目的片段引物和载体的一个内侧引物，共有两种组合，分别来扩增，得到两种PCR产物，这两种产物退火，能够形成开环的分子，即是由载体和插入片段组成的重组子，可直接转化(图5)。第1轮PCR形成的引物二聚体能竞争性抑制插入片段与载体的退火，需要除去。这种方法的效率可达5×103～104个重组子每微克插入片段，然而，为了能够稳定地退火，引物上要引入多到24个碱基的序列，是令人望而生畏的。　　上述6种产生粘性末端的方法的比较见表1。　　需要指出的是，对粘端连接，PCR反应结束后，PCR产物回收时在乙醇沉淀前应分别用酚∶氯仿、氯仿∶异戊醇抽提，以除去Taq DNA聚合酶。否则，残留的Taq聚合酶可能仍有活性，补平粘性末端，使连接反应效率降低［17］。　　以上各种方法各有利弊。对于小于500bp的PCR产物，简单的平头连接就够了。稍大的一些，可以考虑T／A策略。如果摸好了反应条件，SmaⅠ系统可以作得很好。对于后面的6种方法，由于要合成很长的引物，有的还要用一些很少见的酶，操作起来也不方便，若不追求很高的克隆效率，或克隆长达数kb的PCR产物，一般不采用。
图3　利用噬菌体T7 gene 6外切酶产生粘性末端
图4　利用UDG产生粘性末端
图5　利用长的互补末端产生粘性末端
表1　6种产生粘性末端的方法的比较
特　　　　点
优　　　　点
缺点或特殊要求
T4 DNA聚合酶法
利用T4 DNA聚合酶3′→5′外切酶活性和5′→3′聚合酶活性
转化效率很高，每微克载体产生2～5×105个重组子
要求5′端至少要有12个碱基序列
外切酶Ⅲ法
该酶的3′→5′外切酶活性没有序列特异性
效率高，自连背景低
外切酶消化时间很不好掌握
Enase Eam11041法
在识别序列的外侧切割双链DNA，并对甲基化敏感
可定向连接
需用稀少酶类，需用m5dCTP代替dCTP作PCR反应
噬菌体T7 gene6外切酶法
5′→3′外切活性
可定向连接，效率很高
要求配对区域有10多个碱基
选择性降解DNA中dUTP
操作简便，效率高，转化子中几乎没有空载体
引物的5′端加入12个碱基序列，其中T被U代替
延长引物序列法
不需要用限制性内切酶酶类
不需要用限制性内切酶酶类，效率高达5×105重组子／μg DNA
引物上要引入多到24个碱基序列，所需费用较高
作者单位：100005 北京 中国协和医科大学、中国医学科学院基础医学研究所遗传室
参　考　文　献
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PCR引物设计原则
首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) ，再次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。引物设计应注意如下要点：
1．引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp。
2．引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3&端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3&端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。
3．引物3&端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3&端使用碱基A。
4．引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5．引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。合理的退火温度从55℃到70℃。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
6．引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。应该尽量避免。
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